Гашинг и диастатикус

Диастатическая разновидность дрожжей сахаромицетов Saccharomyces cerevisiae уже давно наделала шума в кругах домашних пивоваров. Вспоминаются кадры из сериала «Во все тяжкие», когда детектива пугают стреляющие бутылки с его же собственным домашним пивом. С одной стороны такие дрожжи могут сыграть на руку пивовару при варке сухого сэйзона, но с другой – стать причиной небезызвестного гашинга. Хотелось бы отметить, что выявить такой контаминант «внутри» самих дрожжей гораздо сложнее, чем обнаружить какой-нибудь отдельный патоген-бактерию. Такие дрожжи практически ничем не отличаются от обычных культурных. Ну а теперь поговорим о современных методиках и о том, что это за зверь. 

Генетический код диастатикуса

Как мы знаем пивные дрожжи перерабатывают сахара и производят этанол. В большинстве дрожжевых штаммов в обеспечении этого процесса главную роль играет фермент, называемый глюкоамилазой. Он расщепляет полисахариды и сахарозу на более простые сахара. Появляется у дрожжей благодаря наличию в них семейства STA генов, такое свойство принято называть полигенным (количественным) признаком. Поскольку механизмы, происходящие в клетках, на самом деле достаточно сложны, мы будем говорить о них в несколько упрощенном виде. Так вот, считается, что основным отличием диастатических дрожжей (или на англ. манер - диастатикуса) является присутствие в них особого гена - STA1, который способен высвобождать глюкоамилазу, в то время когда «нормальные» пивные дрожжи  этого делать уже не могут. Высвобождаясь, этот, назовем его - более «наглый» фермент расщепляет, казалось бы, уже несбраживаемые крахмалы и другие сложные молекулярные компоненты на более простые. Получив новую пищу, дрожжи снова принимаются за дело. Далее все интуитивно понятно. Если в данный момент ваше сусло бродило под гидрозатвором, то ничего страшного не случится,продукт, скорее всего, попросту сбродит насухо. Ну а если пиво уже разлито по бутылкам? Почти наверняка вы получите всем уже известный гашинг. В моей практике такое допброжение начинало развиваться после достаточно продолжительной паузы, и, естественно, когда пиво уже было разлито по бутылкам на карбонизацию. Теперь я догадываюсь о причинах, но, столкнувшись с этим впервые, я был, мягко говоря, озадачен.

Так вот на самом деле STA1 это не совсем четкий признак диастатических дрожжей, как мы его описали изначально. Одно лишь наличие этого гена вовсе не означает, что он выражен в дрожжевой клетке настолько, чтобы стать причиной т.н. «переброда» (переаттенюации). Немного усложним описание и введем несколько научных определений.

Совокупность всех генов и генетических признаков, называют генотипом.

Совокупность признаков организма, проявившихся в результате взаимодействия генотипа с окружающей средой, называют фенотипом.

Фенотипичекие признаки по особенностям проявления бывают двух типов: качественные и количественные

Качественные признаки (моногенные) – это отчётливые признаки – развитие и проявление которых зависит от экспрессии (выраженности) генов одной аллельной пары. Это классические менделеевские альтернативные признаки. Они включают в клетке цвет, структуру, пол организма.

Количественные признаки (полигенные, мы говорили о них в самом начале когда упоминали семейство STA генов) – это измеряемые признаки, которые не имеют двух чётких альтернативных форм, демонстрируют широкий спектр фенотипов, имеющих много промежуточных форм. Они обычно контролируются более чем одной парой генов и могут модифицироваться факторами окружающей среды.

Количественные признаки включают в организме рост, вес, цвет кожи, волос, размер органов, форма лица, восприимчивость к  заболеваниям и др. В дрожжах, например,  это выражается в разной толерантности к алкоголю и способности воспроизводить фенолы.

В общем, даже в дрожжах все сложно. Не исключено, что другие гены, помимо STA1, действуют подобно педалям газа и тормоза в автомобиле и  могут регулировать те или иные генные экспрессии - «выраженности».

Поэтому определение лишь гена STA1 полностью не раскрывает всей картины. Оптимальным вариантом для определения риска «переброда» должно быть тестирование дрожжей и на генотип и на фенотип.

Забегая вперед, скажем, что на самом деле чаще всего проблема заключена не в самих диастатических дрожжах, а скорее в неправильном использовании обычных культурных дрожжей или же в банальном заражении. Как же спрогнозировать или определить возможность возникновения этой проблемы? Конечно, хотелось бы иметь какие-нибудь инструменты, помогающий выявить эту беду.  Но в реальности проблема настолько «мегананоскопична», что даже на генетическом уровне определить ее достаточно сложно.

История открытия

Впервые проблему диастатических дрожжей описали английские ученые Бишоп и Уайтли в 1943 году в своем докладе «Система анализа сусла». Чуть позже он был опубликован в институте пивоварения в Лондоне. Темы этого доклада затронули практически все аспекты пивоваренного процесса, от  флокуляции дрожжей до дизайна бродильных танков. При изучении аттенюации (способности дрожжей сбраживать сусло) ученые впервые отметили уникальные дрожжи, которые вели себя довольно необычно. Бишоп и Уайтли тестировали дрожжи и сбраживали сусло в тщательно контролируемых условиях.  Все используемые ими культуры доводили сусло с плотностью 1,025 до 1,011 за 48 часов,  и только один образец №164 за это же время сбраживал его ниже 1,005, т.е. практически насухо. Тогда ученые предположили, что эти дрожжи отличались особой способностью выделять фермент «диастаз», который и расщеплял сложные крахмалы на более простую пищу.  Чтобы проверить свои догадки они приготовили питательную среду, в которой источником углеводов был только крахмал. Они думали, что остальные дрожжи тоже могут выделять этот фермент, но только в другом количестве. По их мнению, эта теория могла бы разрешить многие противоречивые догадки тех времен в отношении способности дрожжей сбраживать декстрины (полисахариды/сложные сахара). Но все оказалось несколько сложнее.

Теперь перенесемся в наш мир и посмотрим, какие эксперименты по определению диастатических свойств дрожжей ставят современные ученые. Автор статьи описывает серию экспериментов доктора М.Фарбера из Университета естественных наук Филадельфии (шт. Пенсильвания).

Выбор дрожжей

Для серии тестов выбрали 9 штаммов коммерческих дрожжей, причем 8 из 9 заранее известны как носители того самого STA1 гена. В своем большинстве это образцы с высокой аттенюацией, способные сбраживать практически все сложные сахара. По большей части это дрожжи бельгийского типа, которые часто используют в сэйзонах.

Следует иметь ввиду, что все известные диастатические штаммы относятся к т.н. POF (phenolic off flavor) позитивным дрожжам, то есть они, практически всегда производят сторонние запахи. В них присутствует ген, который заставляет их выделять 4-винилгваякол или другие фенольные молекулы на чувствительном для человеческого обоняния уровне.

Из выбранных для эксперимента дрожжей при нормальных условиях брожения не все должны были выделять эти фенолы.

В качестве контрольных экземпляров взяли два английских элевых штамма с низкой аттенюацией. Наряду с коммерческими образцами, отобрали 4 промышленных штамма, которые в свое время выделили из зараженных партий пива.

Питательные среды

Селективная питательная среда обеспечивает рост только определенных микроорганизмов. Это важный инструмент любых лабораторий качества. Фарбер разработал и запатентовал свою уникальную среду, которую назвал FPDM (Farber Pham Diastaticus Medium - диастатическая среда Фарбера Фама, Фам – студент, работавший с Фарбером). В качестве селективного агента FPDM использует сульфат меди. Несмотря на то, что биология диастатикуса изучена не до конца, ученому  удалось установить, что по сравнению с контрольными образцами (недиастаическими) диастатические обладают более высокой стойкостью к меди. В качестве пищи для диастатических дрожжей в новой селективной среде используется растворимый крахмал. Механизм работы простой. Дрожжевые штаммы засеивают в чашки Петри, выжидают время и помещают в холод. При охлаждении крахмал становится более видимым. Если посеянный штамм смог его съесть, то вкруг его колонии образуется пустая зона. Среду удалось найти в свободной продаже по цене порядка 180 долл. за флакон. Вот что получилось при тестировании 9 отобранных видов дрожжей.

стильрост в среде FPDM
1бельгийский сэйзон 1слабый
2бельгийский сэйзон 2нет
3дрожжи для плотного эляслабый
4бельгийский крепкийслабый
5бельгийский эльнет
6бельгийский золотой эльсильный
7французский сэйзонсильный
8вайценнет
9дикие дрожжисильный

ПЦР

Для того, чтобы выявить определенный ген, ученые и лаборатории качества часто используют специальный тест ПЦР (полимеразную цепную реакцию). Суть этой техники заключается в усилении какого-либо гена и последующем обнаружении количества его копий. В современном пивоварении эта технология доступна и для пивоваров. Ее производством занимается компания Инвизибл Сентинел. Она доступна в виде т.н. кассет и помогает провести тестирование на лактобациллы, педиококк и диастатические сахаромицеты. Для тестирования на STA1 был выбран инструмент БрюСТАТ от инвизибл сентинел. Колонии девяти уже известных нам образцов поместили в пробирки со специальной средой. Затем пробирки прошли цикл т.н.  усиления, их попеременно нагревали и охлаждали. Для считывания показаний на диастатикус в комплекте БрюСТАТа используются кассеты с антителами. С помощью пипетки образцы переместили в пробирки-индикаторы и оставили на две минуты. Результат присутствия STA1 гена виден как одна или две полоски))) Вот что показали знакомые нам 9 штаммов. 

стильПЦР тест
1бельгийский сэйзон 1положит.
2бельгийский сэйзон 2отриц.
3дрожжи для плотного эляположит.
4бельгийский крепкийположит.
5бельгийский эльотриц.
6бельгийский золотой эльположит.
7французский сэйзонположит.
8вайценположит.
9дикие дрожжиположит.

Спорообразование

Контаминанты, которые способны образовывать споры представляют более серьёзную угрозу для пивоварения, поскольку они способны сводить на нет усилия ряда традиционных методов санитарной обработки.

Чтобы выявить у дрожжей способность к спорообразованию их изучали под микроскопом. Для того чтобы спровоцировать спорообразование, колонии выращенные на YEPD (дрожжевой экстракт пептон декстроза) высеивали в чашку на ацетатный агар(ацетат натрия). В течение трех дней их выдерживали при комнатной температуре вдали от источника солнечного света. Тонкий слой клеток с помощью инокуляционной петли и бунзеновской горелки высаживали на предметные стекла (слайды) для микроскопа  с помощью техники heat-fixing. По мере высаживания пятен, чтобы поддерживать их влажность слайды размещали над паром от горячей воды. Сначала бумагу для промокания пропитывали малахитовой зеленью. Затем помещали ее на стекло, убирали и промывали в течение 10 минут. Второе пятно формировали с помощью бумаги для промокания и красителя сафранина в течение двух минут. Первое пятно показывало все споры голубым цветом, а второе все остальные клетки розовым. Слайды рассматривали при 400 кратном увеличении. (По всей видимости, автор описал технику, известную в микробиологии как метод Ожешко). Результаты оказались следующими:

стильэндоспоры (да/нет)
1бельгийский сэйзон 1да
2бельгийский сэйзон 2да
3дрожжи для плотного эляда
4бельгийский крепкийнет
5бельгийский эльда
6бельгийский золотой эльда
7французский сэйзоннет
8вайценда
9дикие дрожжида

Оценка переаттенюции (переброда)

Все же основная проблема диастатических дрожжей – это их способность фактически «повторно» сбраживать пиво после розлива. Для того чтобы имитировать этот сценарий в лабораторных условиях был проведен следующий опыт. Все девять образцов дрожжей  поместили в уже готовое пиво и дали им возможность в течение недели его сбродить (вне зависимости, могли они это сделать или нет). Выглядело это так. Пиво предварительно отфильтровали от всех сторонних микроорганизмов. Дрожжи внели следующим образом. Штаммы сначала помесили на ночь в питательную среду, затем для адаптации к новому окружению добавили такое же количество пива. В пробирки с 10 мл фильтрованного сусла внесли такое же количество дрожжей и поместили их на 7 дней в инкубатор. Затем для осаждения дрожжей переместили их в холодильник при 4С, тем самым имитировали колд краш. Плотность каждого образца измеряли с помощью денситометра. Корректировку данных на испарение осуществляли с помощью контрольных пробирок с пивом без засеянных дрожжей, которые также помщеали в инкубатор и холодильник. Каждый из тестируемых образцов сравнили с контрольными не-диастатическими английскими элевыми дрожжами. Если штамм сбраживал пиво на 3 единицы плотности (SG) ниже стандарта его признавали потенциально способным к переброду. Результаты получились следующие:

стильпереаттенюация
1бельгийский сэйзон 1да
2бельгийский сэйзон 2нет
3дрожжи для плотного эляда
4бельгийский крепкийнет
5бельгийский эльнет
6бельгийский золотой эльнет
7французский сэйзонда
8вайценнет
9дикие дрожжинет

Биопленки

Еще одна проблема, которая касается диастатикуса и может стать причиной его нежелательного проникновения в пиво – это его способность  образовывать на различных поверхностях весьма устойчивые биопленки. Рассмотрим подробнее, что это такое. Когда микроорганизмы находят подходящее окружение с комфортной для них температурой и питательными веществами на поверхностях этих сред они могут образовывать конгломераты или сообщества, называемые биопленками.

Для лучшего прилипания к поверхности и обмена между собой сигнальными молекулами эти микроорганизмы выделяют т.н. внеклеточный матрикс – полимерное вещество – слизь. Такой микробный «слайм» функционирует как единый псевдо-организм, клетки которого на разных уровнях выполняют разные роли. Для передачи полезных питательных веществ вглубь организма и освобождения от отходов жизнедеятельности наружу, в биопленках формируются специальные каналы. Благодаря таким каналам микроорганизмы получают питательные вещества даже из относительно удаленных от них поверхностей. Со временем некоторые клетки отделяются от материнской биопленки и формируют новые колонии, так происходит «захват» новых поверхностей. Чаще всего биоплёнки образуются в контакте с жидкостями. От механических внешних воздействий микроорганизмы защищены полимерным матриксом. Вредной особенностью биопленок считается наличие в них доминантных устойчивых клеток, которые составляют основу биопленки и способны восстанавливаться после частичного уничтожения.

Что же может произойти в домашнем пивоварении? Почему стоит бояться пленок и диастических дрожжей? К примеру, вы сварили пиво и использовали при этом какие-нибудь культурные или дикие, неважно, диастатические дрожжи. В ы плохо помыли ферментер и эти ребята, не желая исчезать бесследно, решили образовать свой спальный микрорайон - биопленку. Вы сбродили в таком ферментере новое пиво, например, плотный стаут. Старая группировка из «слайма» получила порцию питательной среды и возможно медленно, но верно, принялись за свое, как им кажется, благое дело. Какое-то время им мешали новые стаут-дрожжи, но когда они наелись и опустились на дно, постепенно на первый план стали выходить «диастатикусы».  Но с помощью ареометра вы уже зафиксировали КП, «отколдкрашили» пиво и разлили его в тару.  Что в результате вы получили - пе-ре-брод! А причиной тому была – биопленка с диастатикусами.

Поскольку пивоваренное оборудование считается весьма подходящей средой для такого рода пленок, домашникам необходимо уделять особое внимание санобработке. Пластик и нержавеющая сталь особенно уязвимы в этом плане. Царапины, плохие сварные швы, фитинги, клапаны или насосы – все это потенциальные места роста и распространения микробных комьюнити. Что же делать?

Английские промстандарты предполагают 30 минутную обработку каустическими  агентами всех и без того регулярно моющихся, а потому несильно загрязненных пивоваренных линий. Лабораторные тесты говорят, что особо толстым пленкам необходимо более продолжительное 60-ти минутное воздействие с подачей по линиям свежего раствора каждые 10 минут.

Для домашников лучшей практикой будет регулярная разборка пивоваренного оборудования на компоненты и тщательная обработка горячей водой и каустическими агентами. Сильно поврежденные и изношенные узлы лучше заменять.

Заключение

Как видно из вышеприведенных тестов не все из штаммов, которые обладали геном STA1 или прорастали на селективных питательных средах в итоге стали причиной переаттенюациии в готовом пиве. Скорее более точный результат все же дало последнее тестирование на переброд, потому как оно в некоторой степени аппроксимировало и суммировало все, что происходит в готовом пиве.

Один лишь тест на STA1 не принимает в расчет возможное влияние других малоизученных генов (STA2 и STA3). Доподленно неизвестно каким образом они влияют на диастатическую способность дрожжей. По всей видимости, эта та область, которую ученым еще предстоит изучить.

Какие же можно дать рекомендации пивоварам, чтобы избежать гашинга?

Все просто, домашним пивоварам, чтобы избежать последствий, вызванных диастатическими дрожжами, следует уделять повышенное внимание санитарной обработке пивоваренного оборудования. Взрослые биопленки со временем становятся видны даже невооруженным глазом. Поэтому внимательнее следите за своим пивоваренным скарбом, регулярно его разбирайте, тщательно мойте и хорошо сушите.

Наблюдайте за необычными характеристиками пива, которые выходят за рамки стиля и могут являться признаками заражения. Внимательно следите за изменением плотности брожения. Вы должны знать до какого уровня способны сбраживать сусло выбранные вами дрожжи.

Для дома вовсе обязательно покупать лабораторное оборудование и четко следить за диастатичностью. Более того, сами того не осознавая, возможно когда-то вы уже сбраживали пиво диастатиками и у вас все протекало без проблем. На самом деле это тот момент, которого нужно не опасаться, а просто знать о его существовании. В один прекрасный момент, особенно когда что-то пойдет не так, вы о нем вспомните и в следующий раз не повторите ошибку.

Что же касается коммерческого пивоварения, где диастикус может реально стать проблемой, то для выявления потенциального заражения на предприятиях рекомендуется использовать двойной подход. То есть сначала определять генотип (техника брюСТАТ от ИС), а затем проводить исследование еще и на фенотип (способность дрожжей расщеплять сложные крахмалы). В первую очередь проверке должна подлежать т.н. сырая группа - ингредиенты и оборудование, задействованные на холодном этапе приготовления пива: дрожжи, ЦКТ, линии розлива.

Согласно европейской статистике из 52 случаев заражения пива 48 произошли в домашних условиях. Из них 70% - из-за нарушений санитарных норм при розливе. Поэтому особое внимание пивоваренным компаниям следует уделять санитарной обработке именно этих линий, особенно после варок стилей при приготовлени которых использовались диастатически сильные дрожжи.

При написании статьи использованы материалы К.Робертс "Диастатикус", выдержки из википедии, собственный опыт

Уведомить о
0 комментариев
Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии